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近日，北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院科研團(tuán)隊開展的“通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析和體內(nèi)外實驗探討雞骨草膠囊治療慢性乙型肝炎的機(jī)制”的研究成果正式在《Frontiers in Pharmacology》雜志（2022年影響因子/JCR分區(qū)；5.988/Q1）上發(fā)表。

▲ 圖 | 康臣玉林制藥雞骨草膠囊治療慢性乙型肝炎研究成果榮登《Frontiers in Pharmacology》雜志

研究背景

雞骨草膠囊內(nèi)含三七、人工牛黃、豬膽汁、牛至、毛雞骨草、白芍、紅棗、梔子、茵陳等多種治肝養(yǎng)肝的優(yōu)質(zhì)中藥材，可疏肝利膽、清熱解毒，用于急、慢性肝炎和膽囊炎屬肝膽濕熱證者。另有臨床研究表明，雞骨草膠囊 可用于治療慢性乙型肝炎，但其產(chǎn)生療效的作用機(jī)制尚未完全闡明。該研究旨在通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究和體內(nèi)、外實驗，探討雞骨草膠囊治療乙肝病毒感染的機(jī)制。

研究方法

本研究采用質(zhì)譜（MS）技術(shù)鑒定雞骨草膠囊的活性代謝物，并通過尾靜脈高壓水注射HBV復(fù)制質(zhì)粒建立HBV體內(nèi)復(fù)制小鼠模型。使用脂質(zhì)體將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，采用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞存活率，定量檢測HBV-s抗原（HBsAg）和HBV-e抗原（HBeAg）水平，qRT-PCR和Western blot分別檢測基因表達(dá)和蛋白表達(dá)；通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究獲得雞骨草膠囊治療慢性乙型肝炎的關(guān)鍵通路和關(guān)鍵基因。

▲ 圖 | 雞骨草膠囊治療慢性乙型肝炎的技術(shù)路線圖

研究結(jié)果

01 雞骨草膠囊及其含藥血清分別鑒定出92個和23個化合物，兩者成分進(jìn)行對比分析，推測7, 3’, 4’ -三羥基黃酮、膽酸和脫氧膽酸可能是其主要活性代謝物。

▲ 圖 | 雞骨草膠囊及其含藥血清的總離子色譜圖

02 動物實驗結(jié)果顯示，雞骨草膠囊可降低HBV體內(nèi)復(fù)制小鼠血清HBsAg水平。HE染色結(jié)果顯示，各組肝臟組織均無明顯損傷；免疫組化（IHC）結(jié)果顯示，雞骨草膠囊干預(yù)組的肝臟組織中HBsAg表達(dá)水平明顯降低。

▲ 圖 | 雞骨草膠囊加速HBV復(fù)制C57BL/6J小鼠血清和肝臟組織中HBsAg的消除

03 雞骨草膠囊可降低HepG2.2.15和HepAD38細(xì)胞上清液中HBsAg的水平和細(xì)胞中HBx的mRNA的表達(dá)，并可抑制HepG2.2.15和HepAD38細(xì)胞的增殖，而不影響HepG2和Huh7細(xì)胞的增殖。這表明，其可直接抑制細(xì)胞內(nèi)HBV的復(fù)制，進(jìn)一步抑制HBV相關(guān)肝癌細(xì)胞的增殖。

▲圖 | 雞骨草膠囊體外抑制HBV的復(fù)制和HBV相關(guān)肝癌細(xì)胞的增殖

04 雞骨草膠囊可抑制HBV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Huh7和HEK-293T細(xì)胞中HBeAg的表達(dá)，同時抑制過表達(dá)HBx的Huh7和HEK-293T細(xì)胞的增殖。這表明，雞骨草膠囊可能依賴HBx基因的表達(dá)而抑制HBV的復(fù)制。

▲ 圖 | 雞骨草膠囊抑制HBx表達(dá)非肝細(xì)胞的增殖

05 根據(jù)對雞骨草膠囊的UHPLC-MS/MS分析，Swiss目標(biāo)預(yù)測鑒定出663個靶基因，STITCH鑒定出292個靶基因。去除重復(fù)基因后，最終共鑒定出905個靶基因。利用維恩圖工具上傳雞骨草膠囊的潛在靶點和CHB的疾病靶點提取719個重疊基因（OEGs），網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析顯示雞骨草膠囊作用的關(guān)鍵基因主要是CASP3、CXCL8、EGFR、HSPA8、IL6、MDM2、MMP9、NR3C1、PTGS2等，這些基因之間存在一定關(guān)系。

▲ 圖 | 雞骨草膠囊治療慢性乙型肝炎的網(wǎng)絡(luò)藥理分析

06 KEGG富集分析表明，雞骨草膠囊潛在的靶基因主要與代謝途徑、癌癥途徑、神經(jīng)活性配體-受體相互作用等相關(guān)，關(guān)鍵基因主要參與癌癥通路、膀胱癌中的microRNAs等。GO富集分析結(jié)果表明，雞骨草膠囊潛在靶基因的富集生物過程主要與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白磷酸化、氧化還原過程等相關(guān)，關(guān)鍵基因與多種GO- BP顯著相關(guān)，包括凋亡過程的負(fù)調(diào)控、藥物應(yīng)答、細(xì)胞增殖的正調(diào)控等?；谝陨习l(fā)現(xiàn)，癌癥、乙型肝炎、癌癥中的microRNAs、PI3K-Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和癌癥中的蛋白多糖的途徑都在潛在靶點和關(guān)鍵靶點中富集。由此推測，雞骨草膠囊可能調(diào)節(jié)了CHB相關(guān)的通路，這些生物過程和信號通路可能與雞骨草膠囊治療慢性乙型肝炎作用有關(guān)。

▲ 圖 | OGEs和關(guān)鍵基因的KEGG和BP功能富集

 研究結(jié)論

體內(nèi)和體外實驗研究表明，雞骨草膠囊具有抑制HBV復(fù)制的作用，同時抑制HBV復(fù)制肝癌細(xì)胞系的增殖，其關(guān)鍵代謝產(chǎn)物為3’, 4’, 7-三羥基黃酮、膽酸和脫氧膽酸，作用機(jī)制可能與癌癥通路、乙型肝炎、癌癥中的microRNAs、PI3K-Akt信號通路和癌癥通路中的蛋白聚糖有關(guān)。本研究為雞骨草膠囊的臨床應(yīng)用提供了更廣泛的證據(jù)支持。